二维液相色谱-质谱联用分析阿莫西林中杂质

更新时间：2026-02-05

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阿莫西林（Amoxicillin）又称羟氨苄青霉素，CAS No. 26787-78-0，是一种常用的青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，在高温、光照、酸、碱和氧化等条件下不稳定。临床上证实阿莫西林的聚合物会引起过敏反应，所以在生产和贮存过程中产生的有关物质，直接影响产品质量和临床用药的安全性。

在《中国药典》2020 版中分析阿莫西林有关物质时，采用高效液相色谱紫外检测器法，流动相为磷酸二氢钾溶液和乙腈。由于流动相中含有不挥发性磷酸盐，该方法不能直接进行质谱分析。因此，本方法采用在线柱切换二维液相色谱，将一维目标杂质峰通过阀切换转入二维色谱柱，并进行在线脱盐，然后采用质谱兼容的流动相，实现质谱定性分析。

图1 阿莫西林结构式（MW 365.4）

仪器系统：

Chromai二维液相色谱系统（双三元泵P60、自动进样器A10C、标配两个二位六通阀柱温箱C10V2、紫外检测器D10）

Chromai三重四级杆质谱仪（TQ5000）

图2 Chromai液相色谱-质谱联用仪（TQ5000）

液相色谱条件：

一维色谱柱：Lotus ACC4 4.6×250 mm, 5 μm

二维色谱柱：Lotus AQ-C18 4.6×250 mm, 5 μm

一维流动相A：[0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（2 mol/L氢氧化钾调节pH 至 5.0）]：乙腈=99：1

一维流动相B：[0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（2 mol/L 氢氧化钾调节pH 至 5.0）]：乙腈=80：20

二维流动相A：0.1%甲酸水

二维流动相B：乙腈

柱温：35 ˚C

流速：1.0 mL/min

Loop环体积：1000 µL

进样体积：50 µL

检测波长：254 nm

质谱参数：

电离源：ESI源

扫描模式：

Q1全扫描：正离子模式，m/z: 200-1200

负离子模式，m/z: 80-500

子离子扫描：m/z: 100-400，标准分辨率，CE 10 V，CAD 8

离子源温度：550 ℃

辅助加热气：50 psi

雾化气：40 psi

气帘气：40 psi

样品前处理：

称取阿莫西林20.0 mg，加入一维流动相A超声溶解并定容至10.0 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，待分析。

结果与讨论：

阿莫西林杂质在一维及二维色谱的保留时间见表1，分析时将一维色谱中目标峰收集到Loop环中，再次切阀把目标峰转移至二维色谱柱中，0-10min切至废液实现在线脱盐，10.1min开始切入质谱进行定性分析（见图3）。

表1 二维液相保留时间和柱温箱六通阀切阀时间

一维色谱峰峰号	2	5	6	7	8	9
一维保留时间/min	7.742	25.842	28.905	30.946	33.545	34.259
二维保留时间/min	12.345	12.427	12.544	14.043	13.662	13.767

图3 二维液相色谱质谱联用示意图

色谱图

如图4所示，一维色谱图中1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12号峰为杂质峰，3号峰为阿莫西林主成分。

图4 二维液相色谱中一维色谱图

质谱图

杂质在质谱上的母离子与特征碎片离子分别如下图所示，根据碎片离子与参考文献，可初步推测鉴定阿莫西林中各杂质成分。

图5 各编号杂质峰提取离子流图（提取偏差0.5）

二维液相色谱-质谱联用分析阿莫西林中杂质

表2 各编号杂质峰全扫描与子离子扫描结果汇总

色谱峰编号	正离子全扫描m/z	子离子碎片m/z	负离子全扫描m/z
2	384.35	367.85 323.80 229.60 189.55	382.25、338.20
5	340.25	323.70 229.35 189.25	338.20
6	340.25	323.70 229.50 189.45	338.30
7	366.30	207.50 160.45	364.25、410.25
8	366.25、731.50	396.95 366.85 339.65 311.85 160.25	729.35
9	366.45、731.60	396.95 366.90 339.70 311.80 160.30	729.55

根据表2结果，通过与文献对比，推测如下：2号峰杂质可能为amoxicilloic acid (5S,6R)或amoxicilloic acid (5R,6R) [1, 2]；5号峰与6号峰具有一致的质谱碎片，应互为同分异构体，可能为amoxilloic acid (5S)或amoxilloic acid (5R) [1, 2]；7号峰与阿莫西林主成分具有一致的质荷比，应互为同分异构体，可能为L-amoxicillin, amoxicillin (5R) piperazine-2′,5′-dione或amoxicillin (5S) piperazine-2′,5′-dione [1, 2]；8号峰与9号峰具有一致的质荷比，且质谱碎片基本一致，推测该杂质为阿莫西林二聚体[2]。

结论

本方案使用科诺美特色的双三元泵，采用在线柱切换二维液相与质谱联用的方式，可以对一维色谱分析洗脱出来的目标化合物，通过阀切换转移至Loop环，然后通过另一个泵把Loop环中的洗脱液转移至二维色谱柱上，实现在线脱盐后，立即进行质谱分析。该方法可以快速地对阿莫西林中6 个微量目标杂质进行定性分析，并通过二级质谱的裂解分析，实现相关的结构鉴定，为阿莫西林原料药进行质量控制提供参考。

参考文献

[1]NäGELE E, MORITZ R. Structure elucidation of degradation products of the antibiotic amoxicillin with ion trap MS

and accurate mass determination by ESI TOF [J]. J Am Soc Mass Spectr, 2005, 16(10): 1670-6.

[2]VALVO L, CIRANNI E, ALIMENTI R, et al. Development of a simple liquid chromatographic method with UV and mass spectrometric detection for the separation of substances related to amoxicillin sodium [J]. J Chromatogr A, 1998, 797(1-2): 311-6.